Pasantía internacional de investigación en el área de bioprocesos y biotecnología.

La determinacion de proteinas en mostos y vinos es de gran interes para industria vinicola ya que estas macromoleculas afectan propiedades sensoriales del vino como su color, sabor y textura. Dichas propiedades tiene un impacto directo en la apreciacion y aceptacion del consumidor y por ende en la valoracion de la botella. Las proteinas, a pesar de su baja concentracion, se ven involucradas en procesos como la formacion de precipitados que causan opacidad y turbiedad en el vino blanco, y la precipitacion de taninos, generando perdida de astringencia e inestabilidad del color en vinos tintos. Existen varias tecnicas analiticas para la determinacion de proteinas, algunas complejas y costosas pero de alta precision como HPLC, CG-MS, SD-PAGE entre otras, que ademas requieren pretratamientos complejos para concentracion y purificacion de la muestra. En agricultura se utilizan metodos espectrofotometricos mas sencillos como Bradford y Lowry, sin embargo dichos ensayos resultan poco efectivos en la determinacion de proteinas en jugos de uva y vinos ya que estas son matrices complejas al presentar muy baja concentracion de proteinas y gran cantidad de moleculas como polifenoles, polisacaridos, glutation, sales, pectinas entre otros que interfieren en el proceso de tincion de las proteinas. El protocolo Amido Black, es un metodo espectrofotometrico que ha sido reportado previamente como poco sensible a interferencias y al tipo de proteinas a analizadar. Por lo tanto se ha sugerido que es adecuado para la medicion de proteinas en jugos de uvas y vinos. Amido black se puede resumir es seis sencillos pasos: 1) Precipitacion de las proteinas, 2) fijacion de las proteinas a una superficie solida (filtro), 3) tincion de la proteina con el colorante Amido Black, 4) lavado del exceso de colorante, 5) elucion del colorante hasta una solucion basica y finalmente 6) medicion de la absorbancia de dicha solucion y determinacion de la concentracion de proteinas mediante la curva de calibracion de una proteina estandar. En el laboratorio se detecto que este ensayo presentaba inconsistencias en los resultados obtenidos para uvas hibridas americanas cuando se desarrollaba mediante dos montajes diferentes, 1) en placas de filtros de 96 pozos (96 wells filter plates) con PVDF como material del filtro y 0.45m como tamano de poro, y 2) filtros de 13 mm con nitrocelulosa como material de filtro y 0.22 m como tamano de poro. Por esta razon se decidio analizar la influencia del material y el tamano de poro de del filtro en la retencion de las proteinas, asi como la posible interferencia de moleculas de bajo y alto peso molecular tales como antocianinas y polisacaridos. El analisis experimental consto de tres etapas que se describen a continuacion: 1) Influencia del material y tamano de poro: se realizo el protocolo con las cuatro combinaciones posibles de filtros correspondientes a los dos materiales de interes PVDF y Nitrocelulosa y los dos tamaños de poro 0.22 y 0.45 m. Se analizo la correlacion presentada entre los diferentes resultados 2) Evaluacion de la retencion de proteinas en los filtros: se realizaron dos pruebas. En primer lugar se establecio un protocolo donde en vez de una etapa de filtracion se tuvieran dos para determinar la recuperacion de proteinas en la segunda etapa. La segunda etapa se realizo con el mismo material o con el contrario (e.g PVDF y luego nitrocelulosa). En segundo lugar para confirmar si las perdidas de proteina a traves del filtro eran apreciables se realizo un gel de electroforesis (SDS-PAGE) con el fin de visualizar las bandas de proteinas antes y despues del proceso de filtrado con ambos filtros. 3) Sensibilidad a interferencias: se realizaron dos procedimientos para remover moleculas de bajo y alto peso molecular. En primer lugar extraccion y precipitacion de las proteinas mediante fenol y acetato de amonio en segundo lugar extraccion en estado solido SPE para remover moleculas menores a 6kDa.